來自哈佛-麻省理工Broad研究所、麻省理工學(xué)院和國立衛(wèi)生研究院國家生物技術(shù)信息中心的研究人員，在一項(xiàng)合作研究中發(fā)現(xiàn)了一種高效的Cas9核酸酶，攻克了體內(nèi)基因組編輯面臨的一個(gè)主要挑戰(zhàn)。發(fā)表在《自然》（Nature）雜志上的研究結(jié)果，預(yù)計(jì)將有助于CRISPR工具箱更容易地應(yīng)用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和治療用途。

      最早在細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)，CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠切割DNA，充當(dāng)了對(duì)抗病毒感染的一個(gè)重要防御機(jī)制。盡管許多的微生物物種都擁有這一系統(tǒng)，研究人員優(yōu)先選擇改造了來自化膿鏈球菌的Cas9酶（SpCas9）來改變高等生物的DNA，并已成為一系列高度通用的基因組修飾技術(shù)的基礎(chǔ)。

      要想擾亂成體動(dòng)物中的基因，必須要利用一些載體將CRISPR-Cas9系統(tǒng)的關(guān)鍵元件導(dǎo)入到細(xì)胞中。由于不會(huì)引起人類疾病并已在歐洲獲得臨床監(jiān)管機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)，腺相關(guān)病毒（AAV）被視為是最有前景的候選載體之一。然而，AAV微小的負(fù)載能力使得同時(shí)包裝SpCas9酶和其他基因編輯必需的元件進(jìn)入到單個(gè)病毒顆粒中成為一個(gè)挑戰(zhàn)。

      新研究工作介紹了一種來自金黃色葡萄球菌的Cas9核酸酶（SaCas9），它比SpCas9小25%，從而為AAV的包裝問題提供了一個(gè)解決方案。

      Broad研究所核心成員、麻省理工學(xué)院McGovern腦研究所研究員張鋒（Feng Zhang）領(lǐng)導(dǎo)的研究小組，與麻省理工學(xué)院教授Phillip Sharp及國家生物技術(shù)信息中心的Eugene Koonin合作，著手鑒別出了一種更小的Cas9酶，它既可以復(fù)制當(dāng)前SpCas9系統(tǒng)的效率，并且容許包裝到諸如AAV一類的載體中。研究人員一開始利用比較基因組學(xué)分析了來自600多種不同類型細(xì)菌的Cas9s，選擇了6個(gè)較小的酶進(jìn)行進(jìn)一步研究。

      Koonin說：“通過篩查600個(gè)左右可獲得的Cas9序列，我們發(fā)現(xiàn)了一組酶結(jié)構(gòu)域是完整的，而非酶部分被大大截短的小變異體。幸運(yùn)的是，其中一個(gè)較小的Cas9蛋白被證實(shí)適合開發(fā)論文描述的這種方法。我們現(xiàn)正在積極地探索Cas9和相關(guān)蛋白的多樣性，希望能夠找到一些有潛力促成更強(qiáng)大工具的新變種。”

      經(jīng)過嚴(yán)格的測(cè)試，證實(shí)只有來自金黃色葡萄球菌的Cas9在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的DNA切割效率與SpCas9相當(dāng)。該研究小組隨后利用了由卡羅林斯卡學(xué)院的Nicola Crosetto和法蘭克福歌德大學(xué)的Ivan Dikic開發(fā)的一種方法BLESS，來確定了整個(gè)基因組空間中存在的意外的“脫靶”情況。再一次證實(shí)了SaCas9和SpCas9具有相當(dāng)?shù)腄NA靶向精確度。

      研究利用AAV/SaCas9介導(dǎo)靶向一種有前景的藥物靶點(diǎn)PCSK9，證實(shí)了它的體內(nèi)基因編輯能力。在人體內(nèi)PCSK9喪失與心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)降低及LDL膽固醇水平下降相關(guān)聯(lián)。在小鼠模型中，研究人員觀察到給予AAV/SaCas9后一周血液中的PCKS9幾乎完全耗盡，總膽固醇下降40%。小鼠未表現(xiàn)出明顯的炎癥或免疫反應(yīng)跡象。

      研究的共同第一作者Fei Ann Ran說：“盡管我們?cè)谶@一原理證明研究中選擇的是治療相關(guān)靶點(diǎn)PCSK9，我們的更大目標(biāo)是開發(fā)出通用、高效的系統(tǒng)來擴(kuò)大我們?cè)隗w內(nèi)編輯基因組的能力。”

      更廣泛來說，SaCas9預(yù)計(jì)將提高科學(xué)家們利用動(dòng)物模型篩查突變效應(yīng)的能力，更好地了解基因功能。在未來，或許可以改造它來實(shí)現(xiàn)靶向基因表達(dá)調(diào)控，利用它來擴(kuò)大我們對(duì)于細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳調(diào)控的認(rèn)識(shí)。

      資深作者張鋒說，下一步是比較兩種Cas9s，希望能夠發(fā)現(xiàn)一些進(jìn)一步優(yōu)化這一系統(tǒng)的方法。

      張鋒說：“這一研究突顯了利用比較基因組分析來擴(kuò)展CRISPR-Cas9工具箱的能力。我們的長期目標(biāo)是將CRISPR開發(fā)為一種治療平臺(tái)。這一新的Cas9為擴(kuò)大我們的Cas9清單，幫助我們構(gòu)建出更好的疾病模型，鑒別出一些機(jī)制，以及開發(fā)出新療法提供了一個(gè)支架。”

(來源：生物通)